После потери Родоса Орден Святого Иоанна Иерусалимского уже в который раз остался без убежища. Семь лет странствовали рыцари, побывав за это время на Кипре, в Мессине, Ницце и других местах. А потом испанский король Карл V — император Священной Римской империи — подарил им острова Мальту, Гозо и Комино, прославившиеся чудесами апостола Павла.
В конце сентября 1530 года члены орденского Капитула во главе с Великим магистром прибыли в город Биргу — главный город Мальты, откуда рыцари должны были защищать южное побережье Италии от постоянных набегов тунисских пиратов Получив в ленное владение Мальтийский архипелаг, иоанниты, которых с этих пор стали называть мальтийскими рыцарями, поклялись продолжать неустанную борьбу против мусульман и морских разбойников. Первым подвигом, который совершили рыцари-монахи, стала их помощь императорскому флоту в овладении африканской крепостью Галета — важным форпостом Средиземноморья.
Осваивать новое место жительства рыцари начали с возведения в Биргу госпиталя и нескольких скромных «общежитий» для рыцарей. Однако строительные работы шли вяло и неорганизованно В 1534 году в Мдине скончался Великий Магистр Филипп Вилье де Лиль-Адан, и после его смерти в Ордене начались смуты и междоусобицы. Относительный порядок Удалось навести лишь с приходом к власти Великого магистра Хуана де Хоменеса. Из Италии был приглашен известный архитектор и военный инженер А. Ферромолино, который разработал такую систему обороны Биргу, что город мог выдержать мощный напор противника.
Турки, стремившиеся к господству в Средиземном море, уже с середины XVI века неоднократно нападали на Мальту. В 1551 году, не рискнув атаковать Биргу, расположенную вблизи укрепленной гавани, они разграбили другие районы Мальты и плохо защищенный остров Гозо. После этих событий мальтийские рыцари предприняли энергичные меры по укреплению острова: особенно широкий размах строительство фортификаций приобрело в 1557 году, когда Великим магистром был избран гасконец Жан де ла Валлетт Паризо — один из самых выдающихся деятелей Ордена иоаннитов. Еще при жизни о нем складывали легенды, барды и менестрели воспевали его в своих балладах, священники с амвонов превозносили христианские качества Ла Валлетта. В 28 лет он участвовал в обороне Родоса, и султан Сулейман Великолепный впоследствии горько жалел о своем великодушии, когда узнал, что Ла Валлетт был среди покинувших остров рыцарей.
Осенью 1564 года венецианские купцы (агенты рыцарей в Стамбуле) сообщили, что в турки готовят огромную армию для отправки в Западное Средиземноморье. Их донесение было написано невидимыми чернилами из лимонного сока и спрятано на одном из кораблей среди купеческих счетов. Получив донесение, Великий магистр немедленно направил быстроходную галеру на Сицилию с письмом вице-королю. Он просит о помощи, но ему неведомо, что под самым носом у Ордена орудуют лазутчики турецкого султана Сулеймана Великолепного. Два инженера, славянин и грек, под видом рыбаков посетили Мальту, пересчитали все пушки, отметили расположение батарей, нанесли на карту размеры и систему укреплений острова. К этому времени Орден имел в своем распоряжении укрепленные города Биргу и Сенглея и два форта — Сент-Анжело и Сент-Эльмо. Возведение последнего форта велось инженером, который хорошо знал свое дело. Форт представлял собой мощный, хорошо вооруженный бастион с сильными артиллерийскими позициями.
У Ордена мальтийских рыцарей было всего 8 галер и несколько вспомогательных судов, поэтому бессмысленно было идти навстречу турецкому флоту. Великий магистр, которому было тогда 70 лет, решил дать бой на суше, на хорошо укрепленном острове, хотя общее число его защитников составляло всего 9000 человек.
На рассвете 19 мая 30-тысячная турецкая армия, состоявшая из янычар, под командованием сераскера Мустафы-паши прибыла на Мальту
Турки не смогли взять форт штурмом и поэтому начали готовить артиллерийские позиции для его обстрела. Несмотря на сильный огонь из крепости, они проложили в скалистой почве углубления, которые давали возможность обстреливать рыцарей из разного рода пушек. В результате этого внешние стены и укрепления форта превратились в развалины, и через несколько дней туркам удалось подойти к самым его стенам. Они решили пойти на приступ, однако нападение их было плохо подготовлено, осадные лестницы оказались короткими, и рыцарям удалось отбить атаку, забросав нападавших камнями и поливая их кипящей смолой. В начале июня на помощь туркам подошел пират Драгут, начавший осаду Сент-Эльмо с организации его систематического обстрела. Более 50 рыцарей поставили свои подписи под обращением к Ла Валлетту, в котором заявляли: если Великий магистр хочет их гибели, они готовы вступить в бой с турками и честно в нем погибнуть.
Под покровом ночи из Биргу в форт переправилась комиссия, которой было поручено обследовать положение дел на месте. Ла Валлетт направил 3аШитникам записку, в которой разрешал всем желающим покинуть форт, однако предание рассказывает, что ни один из оборонявшихся не покинул своего места.
В середине июня туркам удалось совершенно отрезать Сент-Эльмо от внешнего мира. Но хотя турецкая артиллерия и разрушала его стены, проникнуть внутрь форта им не удавалось. Огромная турецкая армия плотным кольцом охватила Биргу, но в этот критический момент рыцарям улыбнулась удача. Воспользовавшись сумятицей в лагере врага, в город сумел пробраться отряд, прибывший из Сицилии и насчитывавший в своих рядах 42 рыцарей и 1000 аркебузиров.
Следующую атаку турки предприняли 7 августа, когда пошли на Биргу. У многочисленных пробоин в городских стенах завязались кровопролитные схватки: турки несли огромные потери, но упорно рвались вперед. И хотя численное превосходство все равно оставалось на стороне турок, армия которых насчитывала около 20 000 человек, Мустафа-паша и Пиали-паша решили снять осаду и вернуться в Стамбул.
Осада Мальты была снята 8 сентября — в день Рождества Богородицы. К победным ударам колоколов церкви Святого Лаврентия над руинами Биргу присоединился праздничный перезвон всех церквей Мальты. Только после снятия осады рыцари начали по-настоящему обживать остров. Стены Витториоза были полуразрушены, поэтому решено было возводить новую столицу в соответствии с требованиями военной науки.